ТФФ филтрација тангенцијалног протока у комбинацији са ултрацентрифугацијом за ефикасну припрему малих екстрацелуларних везикула

Мале екстрацелуларне везикуле (сЕВ) су везикуле наноразмера које луче ћелије које садрже нуклеинске киселине, протеине, мале молекуле и друге компоненте и играју важну улогу у међућелијској комуникацији. Мали екстрацелуларни везикули типа егзозома- деле велике сличности са својим родитељским ћелијама. У поређењу са вештачким наночестицама, оне показују ниже стопе уклањања имуног система и нижу цитотоксичност, што их чини обећавајућим кандидатима као новимин виво возила за испоруку лекова. Скоро све врсте ћелија могу да луче ове везикуле, а истраживања о њиховој примени као носачима лека постепено се крећу од лабораторијских ка клиничким применама. међутим,-производња великих размера остаје главно уско грло.

 

Тренутне методе за изолацију екстрацелуларних везикула

Тренутне методе изолације екстрацелуларних везикула укључујуултрацентрифугирање, центрифугирање са градијентом густине, -ексклузиона хроматографија (СЕЦ) и преципитација полиетилен гликолом (ПЕГ).

Преципитација ПЕГ нуди висок принос и једноставан рад, али је повезана са значајном контаминацијом нежељеним протеинима. Центрифугирање са градијентом густине и хроматографија{1}}искључивања величине могу да обезбеде производе високе{2}}чистоће, али је њихова ефикасност релативно ниска и процеси захтевају време-. Ултрацентрифугирање се широко користи, али је његов обим обраде ограничен капацитетом центрифуге, што отежава повећање величине.

 

Примена филтрације тангенцијалног протока за сепарацију сЕВ

Филтрација тангенцијалног протока (ТФФ) је већ примењена на одвајање наночестица као што су липозоми и лентивирусни вектори. У ТФФ-у, довод тече тангенцијално преко површине мембране, што помаже у смањењу запрљања мембране и чини процес лакшим за повећање.

Пошто се мали екстрацелуларни везикули углавном крећу од30–200 нму пречнику, а0,45 μм мембранска касетаможе бити изабран у ТФФ систему за уклањање већих протеина и везикула, док а300 кДа мембранска касетаможе да се користи за уклањање протеина мале молекуларне{0}}тежине и концентрисање малих екстрацелуларних везикула присутних у медијуму културе.

 

Карактеризација сировине након одвајања ТФФ-а

Анализа праћења наночестица (НТА) показала је да су пречници честица углавном распоређени у опсегу0–250 нм.

 

 

Међутим, трансмисиона електронска микроскопија (ТЕМ) открила је велику количину контаминирајућег протеина, док екстрацелуларни везикули нису примећени. Ови резултати су показали да је потребан додатни корак пречишћавања низводно за даље пречишћавање екстрацелуларних везикула.

 

Карактеризација ТФФ концентрата после ултрафилтрације од 100 кДа

ТФФ концентрат је даље обрађен коришћењем а100 кДа ултрафилтрациона цев.

НТА је показао да су пречници честица у концентратима добијеним након једног и два круга ултрафилтрације остали углавном у опсегу од0–250 нм. Међутим, извођење ултрафилтрације два пута је резултирало значајним смањењем броја добијених честица.

ТЕМ анализа је показала да нису уочене структуре сличне везикулама-у концентратима за једнократну- или два- ултрафилтрацију, док је остала значајна количина контаминирајућег протеина.

дакле,Ултрафилтрација од 100 кДа се ​​није могла ефикасно користити за пречишћавање медијума културе након концентрације ТФФ.

 

 

Карактеризација ТФФ концентрата пречишћеног ултрацентрифугирањем

НТА је показао да су пречници честица пречишћених производа углавном распоређени у опсегу од0–250 нм.

Важно је да је ТЕМ јасно открио структуре попут везикула{0}}у различитим видним пољима. Ови резултати су показали да након концентрирања медијума културе коришћењем ТФФ,ултрацентрифугирање се може накнадно применити за даље одвајање и пречишћавање екстрацелуларних везикула.

 

 

Карактеризација сЕВ-а изолованих из кондиционираног медијума мезенхималних матичних ћелија коришћењем ТФФ у комбинацији са ултрацентрифугирањем

НТА је показао да су пречници честица пречишћених производа углавном распоређени у опсегу од0–250 нм.

ТЕМ је приметио структуре сличне везикули{0}}. Вестерн блот анализа је показала позитивну експресију протеина повезаних са екстрацелуларним везикулама{2}}ЦД9, ЦД63 и АЛИКСу пречишћеним екстрацелуларним везикулама.

Ови резултати су потврдили да пречишћене мале екстрацелуларне везикуле садрже егзозоме, што указује да се ова метода може користити и заизолација и екстракција егзозома.

 

 

Закључак: ТФФ у комбинацији са ултрацентрифугирањем за високо-квалитетно сЕВ припрему

Студија је то показалаСамо концентрација ТФФрезултирало је производом који садржи значајну количину контаминирајућих протеина и стога је био недовољан за добијање квалификованих екстрацелуларних везикула.

Исто тако, коришћењем а100 кДа ултрафилтрациона цев за секундарно пречишћавањеније ефикасно дала интактне структуре везикула.

Комбиновањем концентрације ТФФ са накнадним пречишћавањем ултрацентрифугирањем, предности обе технике се могу интегрисати да би се добиловисоко{0}}квалитетни производи малих екстрацелуларних везикула.

У поређењу са самим конвенционалним ултрацентрифугирањем, комбиновани процес може ефикасносмањити укупно време обраде и побољшати ефикасност одвајања.

У овом току рада,ТФФ омогућава брзо обогаћивање великих{0}}семплова, бавећи се ограничењем конвенционалног ултрацентрифугирања у обради великих количина узорака. Ултрацентрифугирање затим врши дубинско пречишћавање како би се уклониле ко-концентроване протеинске нечистоће док истовремено помаже у одржавању чистоће и интегритета везикула.

Штавише, процес не захтева додавањеегзогени хемијски реагенси за таложење, помажући очувању биолошке активности везикула у највећој могућој мери.

Из перспективе индустријског превођења, овај процес је значајанповећати{0}}потенцијали може помоћи у решавању изазова повезаних са -производњом екстрацелуларних везикула заиспорука лекова, регенеративна медицина и развој сродних производа. Такође пружа солидну експерименталну основу за накнадну оптимизацију процеса и пилот{1}}производњу.

 

Референца

Ванг Линг, Ли Менгши, Ксу Ша и др.Успостављање методе за одвајање малих екстрацелуларних везикула филтрацијом тангенцијалног протока у комбинацији са ултрацентрифугирањем. Кинески часопис за биологију, 2022, 35(9): 1096–1101. ДОИ: 10.13200/ј.цнки.цјб.003713.